摘要：目的 研究阿司匹林对大鼠急性心肌缺血损伤的影响以及对Rho亚家族蛋白A/Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2（RhoA/ROCK2）信号通路的调控作用。方法 将SD大鼠随机分为对照组、模型组和实验组，每组15只。实验组大鼠灌胃阿司匹林溶液25 mg·kg-1,对照组和模型组灌胃等量0.9%NaCl溶液，每天1次，连续灌胃15 d.各组大鼠分别于灌胃给药第13,14,15天时，模型组和实验组大鼠皮下注射异丙肾上腺素（ISO）构建急性心肌缺血损伤模型，对照组皮下注射等量0.9%NaCl溶液，每天1次。用酶联免疫吸附法检测干预后各组大鼠血清炎性因子及心肌损伤标志物水平；以苏木精-伊红染色检测心肌组织病理变化；以蛋白质印迹法检测心肌组织RhoA、ROCK2蛋白表达。结果 对照组、模型组和实验组大鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平分别为（78.56±4.52），（125.46±21.58）和（89.46±13.52）pg·mL-1;转化生长因子-β1（TGF-β1）水平分别为（29.56±3.47），（68.49±3.55）和（44.26±2.86）pg·mL-1;内皮素-1（ET-1）水平分别为（24.63±5.61），（59.48±4.62）和（35.46±2.69）pg·mL-1.实验组和对照组分别与模型组比较，差异均有统计学意义（均P<0.05）；与对照组相比，模型组大鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）水平明显升高，且实验组低于模型组（均P<0.05）。结论 阿司匹林可降低急性心肌缺血损伤大鼠炎性反应，减轻心肌损伤程度，抑制心肌组织RhoA/ROCK信号通路活化。
关键词：急性心肌梗死； 阿司匹林； 急性心肌缺血损伤； 炎性反应； Rho亚家族蛋白A/Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2信号通路；
作者简介： 张潇潇（1992-），女，硕士研究生，主要从事药物分子设计与新药研究开发研究； *杨敏，教授，硕士生导师MP:13618515673E-mail:2578973180@qq.com;
Effects of aspirin in rats with acute myocardial ischemia injury
Abstract:Objective To investigate the effects of aspirin on acute myocardial ischemic injury in rats and the regulation of Rho subfamily protein A/Rho-related coiled-coil protein kinase 2（RhoA/ROCK） signaling pathway. Methods SD rats were randomly divided into control group, model group and test group, with 15 rats in each group. Test group was orally administered with aspirin solution 25 mg·kg-1, control group and model group were orally administered with equal amount of 0.9% NaCl, once a day for 15 d. On the 13th, 14th, and 15th days after administration, model group and test group were injected subcutaneously with isoproterenol（ISO） to establish acute myocardial ischemic injury model, control group was injected subcutaneously with equal amount of 0.9% NaCl, once a day. The levels of serum inflammatory factors and myocardial injury markers in rats were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Hematoxylin-eosin staining was used to detect the changes of myocardial tissue pathological; Western blotting was used to detect the expression of RhoA and ROCK2 proteins in myocardial tissue. Results The serum tumor necrosis factor-α（ TNF-α） levels in control group,model group and test group were（ 78. 56 ± 4. 52），（ 125. 46 ± 21. 58） and（ 89. 46 ± 13. 52） pg·mL-1,the transforming growth factor-β1（ TGF-β1） levels were（ 29. 56 ± 3. 47），（ 68. 49 ± 3. 55） and（ 44. 26 ± 2. 86） pg · mL-1,endothelin-1（ ET-1） levels were（ 24. 63 ± 5. 61），（ 59. 48 ± 4. 62） and（ 35. 46 ± 2. 69） pg·mL-1,compared with model group,test group and control group were all with significant difference（ all P < 0. 05）。 Compared with control group,the serum lactate transaminase（ LDH），creatine kinase isoenzyme（ CK-MB） and serum cardiac troponin Ⅰ（ cTnⅠ） levels of model group were significantly increased,and test group was lower than model group（ all P < 0. 05）。 Conclusion Aspirin can reduce the inflammatory response and the degree of myocardial injury in rats with acute myocardial ischemic injury,inhibit RhoA/ROCK signaling pathway activation in myocardial tissue.
Keyword:acute myocardial infarction; aspirin; acute myocardial ischemic injury; inflammatory response; Rho subfamily protein A/Rho-related coiled-coil protein kinase 2 signaling pathway;
急性心肌梗死是严重危害人们生命健康的一种心血管疾病，再灌注治疗是最有效的方法，但也会导致缺血再灌注损伤，即发生部分缺血心肌甚至正常心肌损伤现象[1,2].阿司匹林是一种非甾体抗炎药，具有较好的镇痛、解热、抗炎作用。本研究旨在观察阿司匹林对大鼠急性心肌缺血损伤的影响以及相关作用机制。
材料与方法
1 材料
动物 SPF级雄性SD大鼠，5~6周龄，体重（220±20）g,由贵州医科大学实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK（黔）2018-0001.
药品与试剂 阿司匹林肠溶片，规格：每片100 mg,批号：BJ45356,注册证号：国药准字J20171021,Bayer S.p.A生产；盐酸异丙肾上腺素注射液（ISO），规格：每支1 mg/2 mL,批号：201931026,批准文号：国药准字H31021344,上海禾丰制药有限公司生产。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、内皮素-1（ET-1）酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，均为武汉华美试剂有限公司生产。
仪器 CKX41倒置显微镜，日本Olympus公司产品；Mini Protean3Cell小型垂直电泳仪，北京富瑞恒创科技有限公司产品；Q550图像处理系统，德国Leica公司产品。
2 实验方法
2.1 急性心肌缺血损伤模型构建[3]3]
模型组和实验组大鼠于第1,2天皮下注射8 mg·kg-1 ISO,第3天皮下注射2 mg·kg-1 ISO,对照组皮下注射等量0.9%NaCl溶液，每天1次，连续干预3 d.末次给药后，被麻醉大鼠连接心电图，观察并记录肢体Ⅱ导联心电图是否发生急性心肌缺血改变，作为造型成功判断标准：出现异常Q波，ST段水平上/下偏移≥0.1 mV,T波高耸同时伴有ST段移位；具备以上3种表现之一者为造模成功。
2.2 动物分组与给药方法
将45只大鼠随机分为对照组、模型组和实验组，每组15只。建模前12 d,实验组大鼠灌胃阿司匹林溶液25 mg·kg-1,对照组和模型组灌胃等量0.9%NaCl溶液，各组大鼠均每日1次，连续15 d.
2.3 主要观察指标
2.3.1 以ELISA法检测血清炎性因子水平[4]4]
末次ISO干预后24 h麻醉大鼠，眼眶采血1 mL,室温下静置2 h后，以3000 g离心15 min取上清液，用ELISA法检测血清TNF-α、TGF-β1、ET-1水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。
2.3.2 以蛋白质印迹（Wb）法检测心肌组织RhoA、ROCK2蛋白表达[5]5]
将各组保存于-80 ℃中的大鼠缺血区心肌组织100 mg,加入细胞裂解液进行裂解，电泳后，在收集的蛋白样品中加入缓冲液，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜、蛋白质印迹、ECL显色等，用Western blot法检测心肌组织RhoA、ROCK2蛋白。以β-actin为参照，目标蛋白的相对表达量为RhoA、ROCK2蛋白灰度值分别与内参β-actin的光密度比值。
2.4 次要观察指标
2.4.1 以苏木精-伊红（HE）染色检测心肌组织病理变化[6]6]
大鼠取血后，迅速开胸，摘取心脏，以预冷的0.9%NaCl溶液冲洗血液，取适量心肌组织置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液浸泡固定，常规制作石蜡切片，厚度4 μm,并进行HE染色，于光学显微镜下观察心肌组织病理变化。
2.4.2 以ELISA法检测血清心肌损伤标志物水平[4]4]
末次ISO干预后24 h麻醉大鼠，眼眶采血1 mL,室温下静置2 h后，以3000 g离心15 min取上清液，用ELISA法检测乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同功酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。
3 统计学处理
用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用[Math Processing Error]表示，多组间比较用单因素方差分析，符合正态分布时，2组间比较用LSD-t检验；不符合正态分布时，用秩和检验分析。
结 果
1 各组大鼠血清TNF-α、TGF-β1和ET-1水平比较
与对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、TGF-β1和ET-1水平均明显升高，且实验组均低于模型组（均P< 0.05），见表1.
2 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较
与对照组相比，模型组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnⅠ水平均明显升高，且实验组均低于模型组（均P<0.05），见表2.
表1 各组大鼠血清炎性因子水平比较
TNF-α： Tumor necrosis factor-α； TGF-β1: Transforming growth factor-β1; ET-1: Endothelin-1;Test: Aspirin; Control and model: 0.9% NaCl; Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, #P<0.05
表2 各组大鼠血清心肌损伤标志物水平比较
LDH: Lactate dehydrogenase; CK-MB: Creatine kinase isoenzyme; cTnⅠ： Cardiac troponin Ⅰ； Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, #P<0.05
3 各组大鼠心肌组织病理学变化
对照组大鼠心肌组织结构正常，细胞膜完整，细胞大小均匀，边界清晰；模型组心肌细胞排列不规则，间隙增大，中性粒细胞浸润，出现心肌水肿坏死；实验组心肌组织结构趋于正常，心肌细胞排列相对模型组规则，且仅有少量炎症细胞浸润。
4 各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK2蛋白的表达水平
对照组、模型组及实验组大鼠心肌组织RhoA蛋白相对表达量分别为0.22±0.11,0.78±0.15,0.42±0.16;ROCK2蛋白相对表达量分别为0.46±0.14,0.91±0.12,0.62±0.14.与对照组相比，模型组大鼠心肌组织RhoA、ROCK2蛋白相对表达量明显升高，且实验组显着低于模型组（均P<0.05）。
讨 论
研究表明，炎症反应参与了急性心肌梗死的发病过程，在急性心肌梗死中TNF-α、IL-1β和IL-6高水平表达可迅速激发心肌炎症的发生，进而调控心脏结构和功能的变化，因此减轻心肌组织炎症细胞的聚集可以减轻机体损伤程度[7].本研究中，实验组血清TNF-α、TGF-β1和ET-1水平及LDH、CK-MB和cTnⅠ水平均低于模型组；提示阿司匹林可减轻大鼠急性心肌缺血损伤对心肌细胞的损伤，降低机体炎性反应及心肌酶释放，发挥心肌保护作用。
RhoA属于鸟苷三磷酸（GTP）结合蛋白，ROCK又称Rho激酶，是RhoA的下游效应蛋白，激活RhoA介导其下游信号分子ROCK参与动脉粥样硬化、血管平滑肌痉挛、内皮细胞黏附和炎症反应等心肌梗死发病机制[8].本研究结果显示，实验组大鼠心肌组织中RhoA、ROCK1蛋白表达量低于模型组，提示阿司匹林可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路的活化，发挥对大鼠急性心肌缺血损伤心肌组织的保护作用。
参考文献
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