摘要：将不同的生长调节物质分别在菌丝体阶段和现蕾前期喷施, 研究了6种生长调节物质对白灵菇生长发育过程中菌丝生长速度、菌丝生长势、出菇率、生物学效率、平均产量、现蕾天数和胞外酶活性的影响。结果表明, 芸苔素内酯对白灵菇生长发育调节作用较大, 可使现蕾期提前13 d左右, 同时有效改善白灵菇现蕾前需低温处理的条件;三十烷醇和3-吲哚乙酸对白灵菇生长发育的调节作用次之, 同样能够促进白灵菇提前现蕾和提高出菇率。
关键词：白灵菇; 生长调节物质; 生长发育; 酶活性;
白灵菇 (Pleurotus nebrodensis) 是白灵侧耳的商品名称, 又名白阿魏侧耳、白阿魏蘑、白灵芝菇等, 属担子菌门 (Basidiomycota) 伞菌纲 (Agaricomycetes) 伞菌目 (Agaricales) 侧耳科 (Pleurotaceae) 侧耳属 (Pleurotus) [1]。它主要野生于我国新疆一带伞形科大型草本植物刺芹、阿魏等植株上[2]。其菇肉质细嫩, 味美可口, 被誉为“草原上的牛肝菌”, 同时该菇具有很高的药用价值, 可以调节人体生理平衡, 增强人体免疫功能。白灵菇属于珍稀食用菌, 是我国具有自主知识产权的少数菇种之一, 经济价值较高。
目前白灵菇在栽培过程中存在诸多问题:现蕾不均匀、现蕾率低, 具体表现在生产中菌棒要么现蕾多但成活率低, 要么现蕾极少, 不出菇, 不易控制;与其他菇种相比, 其菌丝长满菌袋后仍需60 d以上的后熟期, 且必须低温3～8℃催蕾, 生产中经常因技术水平要求太高而导致失败, 从而制约了它的产业化发展。研究解决白灵菇生产中存在的这些问题, 对于白灵菇产业来说迫在眉睫。
生长调节剂在很多农作物上得到应用。研究表明, 其能够有效改善作物品质, 使产量提高, 并且有改善收获和贮存条件等作用, 使用后可取得显著的经济效益[3]。近年来, 关于生长调节物质在食用菌上的应用逐渐增多, 特别是国外已经将生长调节物质的使用作为食用菌产量及品质提升的关键因素, 并且已经商业化, 但关于生长调节物质对白灵菇生长发育及酶活性的影响研究较少。白灵菇生长发育主要依靠自身不断分泌各种胞外酶来分解、吸收培养基中的碳氮营养[4]。胞外酶的活性同培养基质中纤维素的降解速度和食用菌子实体产量有关[5]。叶叙丰等[6]研究发现, 在香菇栽培出菇阶段喷施三十烷醇, 可适当增产并提高子实体内总氨基酸态氮的含量。尹红芳[7]研究表明, 赤霉素、三十烷醇对毛木耳的菌丝生长具有一定的促进作用。张慧锋[8]研究发现, 在蛹虫草培养基中适量添加植物生长调节物质, 能够提高蛹虫草的多糖含量, 促进子实体生长。这些研究均表明, 生长调节物质应用于食用菌生产, 能够诱导细胞的分裂和伸长, 激活并提高多种酶的活性, 加快机体的代谢活动, 同时增强菌丝生长过程中对营养物质的吸收和利用, 从而加速菌丝的生长, 促进菌丝体扭结现蕾, 进而使子实体快速生长, 并且使用后子实体具有个头大、品质优且外观商品性好等特点[9,10,11,12,13]。而生长调节物质的这些功效, 正是解决白灵菇生产中存在的上述问题的关键所在。
本试验通过研究多种生长调节物质对白灵菇生长发育及胞外酶活性的影响, 进而为下一步解决白灵菇现蕾不均匀、现蕾率低、后熟期太长、需要低温促熟等生产实际问题提供解决途径。
1 材料和方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株
供试菌株编号为BL-2, 由山西省农业科学院食用菌研究所保藏。
1.1.2 试剂与仪器
三十烷醇、芸苔素内酯、3-吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤、赤霉素、萘乙酸, 购自广州林国化肥有限公司;3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) , 购自上海生工生物技术有限公司。水浴锅 (恒温) (50±1) ℃, 电热干燥箱 (80±1) ℃, TU-1810PC型紫外可见分光光度仪, 均购自北京普析通用仪器有限责任公司。
1.1.3 培养基配方
培养基配方:蛋白胨2 g, 葡萄糖20 g, Mg SO40.5 g, KH2PO41 g, 酵母浸膏4 g, 琼脂15 g, VB110 mg, 水1 000 m L, pH值自然。
栽培袋配方:木屑55%, 棉籽皮20%, 玉米芯10%, 麸皮10%, 玉米粉3%, 石灰1%, 石膏1%。料∶水=1∶ (1.1～1.2) 。
在高温 (121℃) 、高压 (110 kPa) 下灭菌。
1.2 菌袋制作管理及不同生长调节物质处理方法
1.2.1栽培管理
菌袋每袋装干料250 g, 含水量调至65%, 搅拌均匀后, 装至17 cm×33 cm×0.05 cm聚丙烯塑料袋内, 码入灭菌锅, 温度调至121℃, 高压灭菌2.5 h, 冷却至室温, 超净工作台无菌操作接种。接种完成后, 将栽培袋置于培养箱中培养, 温度设置为 (25±1) ℃。栽培袋菌丝长满时移入培养室, 在 (22±1) ℃条件下进行后熟管理。
后熟培养30 d, 进行搔菌, 随后继续培养5 d, 再移入可控温出菇房, 按照试验设计, 部分进行温差刺激催蕾, 温度控制在4～15℃, 空气相对湿度90%～95%。出菇期温度控制在 (14±2) ℃, CO2浓度≤1 000 mg/L, 空气相对湿度90%～95%。在催蕾和出菇期间, 昼夜光照交替[14]。
1.2.2 生长调节物质配制及喷施方法
其配制方法列于表1。在灭好菌的培养袋接种口处喷施不同浓度的已灭菌 (用针筒式微孔滤膜过滤器) 生长调节物质1 m L, 然后接种, 接种等量的原种, 设5个重复, 然后常规栽培培养, 观察各生长阶段情况, 随后在催蕾期往接种面上喷施1 m L不同种类的生长调节物质, 进行现蕾期观察。
表1 生长调节物质配制
1.2.3 取样方法
接种后第10, 20, 35, 45, 55, 65, 70, 75, 85, 95, 105, 115天进行取样, 基本为每隔10 d取样一次, 取样部位为菌袋的接种点向下2 cm处、中部和距底部2 cm处, 每个部位3次重复, 每次取样将单个重复的3个部位的样品混匀待用。
1.3 测定项目及方法
1.3.1 生理特性的测定
每个处理随机抽取5个菌袋, 接种10 d后, 在菌袋外侧划线, 之后每隔5 d划线1次, 划第3次后计数统计, 并计算菌丝的平均生长速度[15]。
现蕾天数按喷施不同生长调节物质后出现第一个菇蕾的时间记录。
生物学效率= (子实体鲜质量/培养料干质量×100%) [14] (1)
1.3.2粗酶液制备和酶活性的测定
从每个处理中随机抽取3个菌袋, 将取出的培养料混匀, 加5倍蒸馏水, 室温下浸提1 h, 过滤去渣, 上清液即为酶提取液, 测定羧甲基纤维素酶活性和半纤维素酶活性。
1.3.2. 1 纤维素酶 (CMC) 活性测定
取3支15 m L刻度试管分别加入0.2 m L酶液, 再分别吸取1.8 m L CMC溶液, 50℃水浴保温30 min, 空白样用0.2 m L酶液, 加入1.8 m L醋酸缓冲液, 同样50℃水浴30 min, 再吸取DNS 2 m L摇匀后, 具塞, 沸水浴反应10 min, 冷却后, 补加水至15 m L, 轻轻上下摇匀, 用空白调零点, 于550 nm下测OD值[16,17,18,19]。
1.3.2. 2 半纤维素酶 (HC) 活性测定
15 m L刻度试管中加入酶液0.2 m L, 再各吸取1.8 m L 1%的木聚糖溶液, 摇匀, 50℃水溶60 min, 取出后, 再吸取2 m L DNS试剂摇匀, 具塞, 立即沸水浴反应10 min, 冷却后, 补加水定容到15 m L, 轻轻上下摇匀, 空白用0.2 m L酶液、1.8 m L醋酸缓冲液, 不加木聚糖溶液, 同样依上述步骤, 用空白调零点, 于550 nm下测OD值[16,17,18,19]。
1.4 统计分析
采用SPSS 22.0对不同处理的菌丝生长速度、出菇率、酶活性等指标进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 不同生长调节物质对白灵菇生理特性的影响
由表2可知, 7种生长调节物质对白灵菇菌生理特性均产生影响。在菌丝生长速度方面, 7种生长调节物质均能加速菌丝生长, 其中, 三十烷醇和6-苄氨基嘌呤处理后菌丝生长速度较快, 分别为6.84, 6.62 mm/d, 与CK之间差异达极显著水平, 其次为赤霉素、芸苔素内酯和3-吲哚乙酸, 分别为5.74, 5.66, 5.44 mm/d, 与CK间差异达显著水平, 萘乙酸对菌丝生长速度影响较小, 仅为4.49 mm/d。
喷施三十烷醇和芸苔素内酯的培养袋菌丝长势最旺盛, 3-吲哚乙酸和赤霉素处理后的长势次之, 萘乙酸处理后与CK对比差异不显著, 而6-苄氨基嘌呤处理后菌丝长势较弱。
表2 不同生长调节物质对白灵菇生理特性的影响
注:生长势分别用 , , , 表示。菌丝长势旺盛、浓密、粗壮用 表示;菌丝长势较好、浓密用 表示;菌丝长势一般、略密用 表示;菌丝生长较弱、稀疏、纤细用 表示。表中数据后不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。图1, 2同。
不同生长调节物质对出菇率影响较小, 喷施芸苔素内酯后出菇率最高, 可达98.76%, 三十烷醇次之, 达98.49%, 二者之间差异不显著。喷施3-吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤和萘乙酸与CK之间差异未达显著水平, 仅有赤霉素喷施后表现出出菇率降低的趋势, 但与CK之间差异不显著。
喷施这7种生长调节物质后, 生物学效率与平均产量变化趋势一致, 芸苔素内酯和三十烷醇处理后的生物学效率和产量均较高, 分别为62.79%, 61.32%和251.16, 245.28 g/袋。3-吲哚乙酸和赤霉素处理后生物学效率与产量与CK之间差异显著。6-苄氨基嘌呤和萘乙酸处理后, 与CK之间差异未达显著水平。
喷施芸苔素内酯后现蕾天数最短, 为 (108±2) d。三十烷醇处理后比CK现蕾天数提前6 d, 3-吲哚乙酸和6-苄氨基嘌呤处理后现蕾天数相近, 比CK现蕾天数均提前2 d, 赤霉素和萘乙酸处理后现蕾天数与CK表现一致。
2.2 不同生长调节物质对白灵菇酶活性的影响
2.2.1 不同生长调节物质对白灵菇不同生长阶段纤维素酶活性的影响
从图1可以看出, 喷施不同生长调节物质后, 对白灵菇不同生长发育阶段羧甲基纤维素酶活性影响不同, 但总体变化趋势与CK保持一致, 即现蕾前较低, 现蕾后迅速升高。芸苔素内酯对羧甲基纤维素酶影响最大, 喷施之后在各个阶段均能显著提高其活性, 与CK之间差异显著。第105天时达最大值 (20.2 U) , 随后急剧降至14.5 U。三十烷醇影响次之, 与CK之间差异也达显著水平, 其在第70天时, 酶活性最低, 为1.6 U, 随后快速上升, 在第105天时达最大值, 为19.3 U。6-苄氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸对白灵菇各生长阶段的羧甲基纤维素酶活性虽能提高, 但与CK之间差异不显著。所有处理均表现出在后熟期开始至第45天达第1个峰值, 随后降低, 在第70天达最小值, 随后急剧上升, 在第105天时达第2个峰值, 随后又下降。
2.2.2 不同生长调节物质对白灵菇不同生长阶段半纤维素酶活性的影响
从图2可以看出, 喷施生长调节物质后, 白灵菇不同生长发育阶段半纤维素酶活性均有提高, 但总体趋势与CK保持一致, 即现蕾前较低, 现蕾后迅速升高。芸苔素内酯对半纤维素酶影响最大, 喷施之后在各个阶段均能显著提高其活性, 在第105天时达44.3 U, 与CK之间差异极显著, 随后115 d时, 急剧下降为6.23 U, 此时半纤维素酶活性与CK之间差异仍达显著水平。
其次为3-吲哚乙酸和三十烷醇, 对半纤维素酶活性影响二者之间差异不显著, 与CK之间差异显著, 在第105天时均达最大值, 分别为44.3, 45.9 U, 随后又分别急剧降至5.1, 5.23 U。6-苄氨基嘌呤、赤霉素和萘乙酸对白灵菇各生长阶段的半纤维素酶影响与CK之间差异不显著。所有处理均表现出在第35天时达第1个峰值, 随后降低, 在第65天时达最小值, 随后急剧上升, 在第105天时达第2个峰值, 随后又下降。
3 结论与讨论
不同种类的生长调节物质施用可明显促进白灵菇菌丝生长, 缩短发菌和现蕾时间, 使出菇相对集中, 提高产量, 改善品质。本研究结果表明, 芸苔素内酯对白灵菇生长发育调节作用较大, 可使现蕾期提前13 d左右, 同时有效改善白灵菇现蕾前需低温处理的条件。三十烷醇和3-吲哚乙酸对白灵菇生长发育的调节作用次之, 对白灵菇的提前现蕾和提高出菇率也有促进作用。这些结果应该与生长调节物质能够促进白灵菇细胞分裂, 进而增强胞外酶活性有关[20]。
虽然本研究为解决白灵菇现蕾不均匀、现蕾率低、后熟期太长、需要低温促熟等生产实际问题提供了依据, 但本研究只针对单一生长调节物质喷施后的影响进行了研究, 尚未对复合型生长调节物质的影响做进一步研究, 另外, 关于生长调节物质使用的最佳时期和浓度还有待于进一步探索。
参考文献
[1] 黄年来, 林志彬, 陈国良, 等.中国食药用菌学[M].上海:上海科学技术文献出版社, 2010:548.
[2] 危贵茂, 钟卫民, 欧阳建华.白灵菇液体菌种培养条件及栽培试验[J].食用菌学报, 2005 (2) :47-52.
[3] 胡友财.新型植物生长调节剂的研究[D].沈阳:沈阳药科大学, 2003.
[4] 赵占军, 张勇, 李毅, 等.白灵菇生理生化研究进展[J].山西农业科学, 2012, 40 (3) :292-294.
[5] 朱铁群.生长调节剂对香菇不同品种菌丝生长和羧甲基纤维素酶活性的影响[J].河南农业科学, 1997 (10) :27-28.
[6] 叶叙丰, 陈敬祥.三十烷醇对香菇的增产效应[J].食用菌, 1983, 5 (3) :33.
[7] 尹红芳.生长调节物质对毛木耳菌丝生长的影响[J].食用菌, 2008, 30 (5) :9.
[8] 张慧锋.北冬虫夏草子实体培养条件的探索[J].吉林医药学院学报, 2005 (4) :192-194.
[9] 蒋冬花, 张萍华.深层培养诸因素对金针菇菌丝体生长的影响[J].食用菌学报, 1997, 4 (3) :40-44.
[10] 张占甲, 陈坤明, 李仲芳, 等.不同配比的赤霉素和激动素与营养液配施对平菇产量与品质的影响[J].食用菌学报, 1995, 2 (1) :43-48.
[11] 高书歧, 刘振华.激素在平菇生产上的应用研究[J].食用菌, 1997, 19 (3) :7.
[12] 蒋冬花, 张萍华.植物生长调节剂对平菇菌丝生长和产量的影响[J].浙江师大学报 (自然科学版) , 1996, 19 (4) :86-89.
[13] 胡世宽, 段普凡, 李书生, 等.菇壮素在食用菌生产上的应用[J].食用菌, 1994, 16 (3) :5-6.
[14] 冯作山.白灵菇栽培配方优化与生理生化特性研究[D].北京:中国农业科学院, 2011.
[15] 李素玲, 许晶, 姚六明, 等.高温香菇品种栽培比较试验[J].山西农业科学, 2018, 46 (1) :39-41.
[16] 黄春霖, 林辰壹, 刘玉, 等.巴尔喀什黑伞3种胞外纤维素酶活力变化规律研究[J].天津农业科学, 2018, 24 (11) :54-57.
[17] 王玉万, 王云.培养温度和侧耳子实体形成对胞外纤维分解酶活性的影响[J].微生物学通报, 1991, 18 (1) :9-11.
[18] 路等学, 王龙, 高静梅, 等.茶薪菇不同生长期几种胞外酶活性的测定[J].华北农学报, 2009, 24 (Z) :275-277.
[19] 夏振强, 暴增海, 周超, 等.抗真菌海洋细菌L1-9菌株的几种胞外酶活性测定[J].河南农业科学, 2009 (7) :74-77.
[20] 申挺挺, 郭�B, 李欣欣, 等.杏鲍菇、白灵菇对芦笋老茎中木质纤维素的分解利用[J].山西农业科学, 2011, 39 (11) :1170-1173.