摘 要： 目的 通过对沙棘籽提取物配方制剂进行小鼠急性毒性试验、遗传毒性试验 (小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验和精子畸形试验) 和大鼠30天喂养试验, 评价其食用安全性。方法 小鼠急性毒性试验采用最大耐受量法, 20只小鼠禁食后单次灌胃给予配方沙棘籽提取物18.58 g/kg (相当于原花青素1.115 g/kg) , 连续观察14 d。Ames试验采用鼠伤寒沙门菌TA97a、 TA98、TA100、TA102四株试验菌株, 在加与不加S9 (代谢活化系统) 时, 观察配方沙棘籽提取物对测试菌株有无明显抑菌作用。小鼠骨髓细胞微核试验采用30 h给药法, 对小鼠股骨骨髓进行制片、染色并记录骨髓细胞微核率和嗜多染红细胞数占红细胞总数的百分比。精子畸形试验对雄性小鼠持续给药5 d, 第35天处死动物后取两侧副睾精子涂片并染色, 记录畸形精子数量和类型, 计算畸形精子发生率。大鼠30天喂养试验选用Wistar大鼠按人体推荐剂量25、50和100倍的剂量给予配方沙棘籽提取物30 d, 然后对每只动物进行大体检查、血液学和血生化指标检测, 以及病理组织学检查。结果 配方沙棘籽提取物对昆明小鼠急性毒性分级标准评价为无毒级, 在2周观察期内小鼠均未见明显中毒症状, 亦无死亡。小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验和精子畸形试验结果均为阴性。30天喂养试验中, 大鼠精神、行动正常, 未见死亡。各剂量组体重、进食量和食物利用率与阴性对照组结果一致, 血液学、血液生化学指标均在实验室正常值范围内, 与对照组比较差异均无统计学意义。病理组织学检查也未观察到和给药相关的病变。故认为配方沙棘籽提取物30天喂养试验未观察到有害作用水平 (NOAEL) 为5.00 g/kg。结论 未发现配方沙棘籽提取物有明显的毒性作用。
关键词： 沙棘籽提取物; 原花青素; 毒性;
沙棘 (Hippophae rhamnoides Linn.) 为蔷薇目胡颓子科沙棘属灌木, 我国三北高原大面积种植, 其根系发达, 可以防风固沙。沙棘也是一种药食同源性植物, 根茎、枝叶、果实、种子等都有营养和药用成分。沙棘果实具有利肺止咳、活血散瘀的功效, 沙棘叶是家畜的优良牧草, 沙棘籽经过超临界萃取或亚临界低温萃取可以得到沙棘籽油。沙棘果油和沙棘籽油具有抗衰老、抗溃疡、治疗烧伤、治疗妇科疾病以及抗辐射、抗肿瘤等多种功效, 作为保健食品原料已经得到广泛应用[1], 沙棘籽渣为沙棘籽榨油后的残渣, 目前多用于饲料。研究表明, 沙棘籽中的大部分生物活性物质在提油之后仍遗留在油渣中, 沙棘籽渣含有丰富的蛋白质、糖类和可食纤维素等多种营养成分以及酚性、鞣质、甾体、萜类、黄酮及其苷类等多种生物活性成分[2]。探索沙棘籽渣提取物的食用价值, 有利于提高沙棘资源的利用率。本文对配方沙棘籽提取物进行急性毒性、遗传毒性和30天经口毒性试验, 为其开发利用提供科学依据。
1、 材料与方法
1.1、 配方沙棘籽提取物
配方沙棘籽提取物由北京某健康产业有限公司提供。将沙棘籽脱脂后, 经过提取、浓缩、干燥得到粉状物, 再与沙棘籽油和沙棘果油进行组方, 使用蜂蜡混悬, 得到均匀的油粉混悬液。其中沙棘籽提取物25%～30%、沙棘籽油30%～35%、沙棘果油30%～35%, 蜂蜡5%～10%。主要有效成分沙棘原花青素含量为6 g/100 g, 维生素E 60 mg/100 g。人群推荐摄入量为3.0 g/d, 产品密度为0.929 g/mL。
1.2、 仪器和试剂
CX21型正置显微镜 (日本奥林巴斯株式会社) , MEK-6318K型自动血球计数仪 (日本光电工业株式会社) , 7020型全自动生化分析仪 (日本日立高新技术株式会社) , 鼠伤寒沙门菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株 (美国moltox公司) 。生化检测试剂为上海丰汇生物医药有限公司提供。环磷酰胺由江苏恒瑞医药股份有限公司提供。
1.3、 实验动物
SPF级昆明种小鼠和4周龄Wistar大鼠, 均购自湖北省实验动物研究中心, 生产许可证号SCXK (鄂) 2015-0018。饲养于湖北省食品药品安全评价中心SPF级屏障动物房, 使用许可证号SYXK (鄂) 2012-0065。动物适应性喂养3 d, 检疫合格后使用。
1.4、 小鼠急性毒性试验
小鼠20只, 雌雄各半, 体重18.0～22.0 g, 禁食16 h后按20 mL/kg单次灌胃配方沙棘籽提取物18.58 g/kg, 相当于人群推荐日摄入量的371.6倍, 连续观察14 d。
1.5、 小鼠骨髓细胞微核试验[3]
小鼠雌雄各25只, 体重25.0～30.0 g。按体重随机分为5组, 每组10只, 阴性对照组灌胃大豆油, 阳性对照组灌胃环磷酰胺40 mg/kg, 配方沙棘籽提取物低、中、高剂量组灌胃剂量分别为2.50、5.00和10.00 g/kg。采用30 h给药法, 即动物第一次灌胃后, 间隔24 h再第二次给予受试物, 再间隔6 h处死动物。取动物股骨骨髓液, 与适量小牛血清混匀, 常规涂片, 自然干燥后放入甲醇中固定5～10 min, Giemsa染色。在油镜下观察, 计数每只动物嗜多染红细胞和成熟红细胞的比例, 并观察含有微核的嗜多染红细胞数, 微核率以千分率表示。
1.6、 Ames试验[3]
采用鼠伤寒沙门菌TA97a、 TA98、TA100、TA102四株试验菌株, 在加与不加S9 (代谢活化系统) 时, 观察8、40、200、1000和5000 μg/皿 5个剂量组对测试菌株的抑菌作用。实验同时设3个对照组, 分别为自发回变对照、溶媒对照和阳性对照。各菌株及各对照组在每一浓度均做3个平皿作为平行对照, 以上各皿在顶层琼脂中加入0.1 mL试验菌株增菌液、0.1 mL受试物溶液和0.5 mL肝匀浆S9混合液 (当需要代谢活化时) , 混匀后倒入底层培养基平板上。37 ℃培养48 h, 计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变组菌落数2倍以上, 并具有剂量-反应关系者则定为阳性。
1.7、 小鼠精子畸形试验[3]
雄性小鼠25只, 体重25.0～35.0 g, 按体重随机分为5组, 每组5只。分组及剂量同1.5节, 持续给药5 d, 第35天用颈椎脱臼法处死小鼠, 取出两侧副睾, 放入盛有2 mL生理盐水的平皿中, 将副睾纵向剪1～2刀, 静止3～5 min, 轻轻摇动。用四层擦镜纸过滤, 吸滤液涂片, 甲醇固定, 1%～2%伊红染色。在高倍镜下检查精子形态。每只动物至少检查1000个精子, 并计算畸形精子发生率 (以千分率计) 。
1.8、 大鼠30天喂养试验[3]
4周龄Wistar大鼠雌雄各40只, 体重70.0～90.0 g, 随机分为4组。按照配方沙棘籽提取物人群推荐日摄入量的25倍、50倍和100倍, 设1.25、2.50和5.00 g/kg三个剂量组, 大豆油为对照组。受试物采用大豆油配制, 各组灌胃容量均为6.0 mL/kg, 每天1次, 连续30 d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量, 计算每周及总的食物利用率。末次给药后禁食16 h, 采用2%戊巴比妥钠溶液麻醉动物, 腹主动脉采血进行血液、生化指标的检测, 放血处死动物, 进行大体解剖观察, 并取肝、肾、脾、睾丸称重, 计算其相对重量 (脏/体比值) 。对高剂量组和对照组动物的肝、肾、脾、胃肠、睾丸及卵巢进行组织病理学检查, 病理改变程度分“-”、“ ”、“ ”、“ ”四级量化评价。
1.9、 统计学分析
实验数据用Microsoft Excel软件建立数据库, 按动物性别分别统计。计量资料采用t检验, 率的统计采用卡方检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2、 结果
2.1、 小鼠急性经口毒性试验
在2周观察期内, 小鼠精神良好, 活动自如, 未见明显中毒症状, 亦无死亡。雌性小鼠终体重 (30.5±2.6) g, 雄性 (36.9±4.7) g。按急性毒性分级标准评价, 配方沙棘籽提取物属无毒级。
2.2、 遗传毒性试验
2.2.1、 小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸形试验
由表1可见, 与阴性对照组比较, 阳性对照组小鼠微核率及精子畸形率均显着增加 (P<0.01) 。配方沙棘籽提取物各剂量组微核率均在5‰以下, 精子畸形率均在20/‰以下, 与相应对照组比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
表1 配方沙棘籽提取物对小鼠骨髓细胞微核发生率及小鼠精子畸形发生率的影响(n=5,X???±s)(n=5,X?±s)
2.2.2、 Ames试验
设计8、40、200、1000和5000 μg/皿5个剂量组, 配方沙棘籽提取物对鼠伤寒沙门菌TA97a、 TA98、TA100和TA102四株试验菌株, 在加与不加S9 (代谢活化系统) 时, 均无明显抑菌作用, 且各剂量组回变菌落数均未超过阴性对照菌落数2倍, 亦无剂量-反应关系, Ames试验结果为阴性。
2.3、 大鼠30天喂养试验
2.3.1、 动物一般表现
试验期间动物行为、外观、毛发、大小便均正常, 未见动物死亡。
2.3.2、 对大鼠体重、摄食量、食物利用率的影响
由表2可见, 配方沙棘籽提取物各剂量组大鼠体重增重、进食量和总食物利用率与阴性对照组比较差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
表2 配方沙棘籽提取物对大鼠体重增重及总食物利用率的影响(n=10,X???±s)(n=10,X?±s)
2.3.3、 对大鼠血液学的影响
由表3可见, 试验结束时配方沙棘籽提取物各剂量组红细胞计数 (RBC) 、血红蛋白含量 (Hb) 、白细胞计数 (WBC) 、血小板计数 (PLT) 、淋巴细胞百分比 (LY%) 、中间细胞百分比 (MO%) 、中性粒细胞百分比 (GR%) 与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 且均在实验室历史正常值范围内。
表3 配方沙棘籽提取物对大鼠血常规的影响(n=10,X???±s)(n=10,X?±s)
2.3.4、 对大鼠血液生化学的影响
由表4可见, 试验结束时配方沙棘籽提取物各剂量组血糖 (Glu) 、血清白蛋白 (ALB) 、总蛋白 (TP) 、丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 、门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、血清尿素氮 (BUN) 、总胆固醇 (TC) 、甘油三酯 (TG) 、肌酐 (Cr) 等指标与阴性对照组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 且均在实验室历史正常值范围内。
表4 配方沙棘籽提取物对大鼠血液生化学的影响(n=10,X???±s)(n=10,X?±s)
2.3.5、 病理学检查
各组大鼠各脏器肉眼均未见明显异常, 配方沙棘籽提取物各剂量组脏器重量及脏/体比值与阴性对照组比较, 差异均无统计学意义 (P>0.05) , 且均在正常值范围内。对照组镜下可见个别动物肝脏内少量肝细胞脂肪变性 (1/20, 雌性1/10, 雄性0/10) ;个别动物肾脏内少量肾小管透明管型 (1/20, 雌性0/10, 雄性1/10) ;脾脏、胃肠、卵巢、睾丸等脏器未见明显异常。配方沙棘籽提取物高剂量组个别动物肝脏内少量炎性细胞浸润 (1/20, 雌性1/10, 雄性0/10) ;肾脏、脾脏、胃肠、卵巢、睾丸等脏器未见明显异常。
3、 讨论
本文的受试物是沙棘籽提取物与沙棘籽油和沙棘果油的混合制剂, 其中原花青素是其主要功效成分, 含量超过6 g/100 g。目前普遍认为原花青素安全性较好[4], 但研究多集中在葡萄籽原花青素上。谢文利等[5]研究了纯度为95%的葡萄籽原花青素, 发现其半数致死量 (LD50) 为2.75 g/kg, 按毒性分级标准属于低毒级;陈会丛等[6]以428.57、214.29和42.86 mg/ (kg·d) 的剂量给大鼠连续灌胃26周未见明显的毒副作用。
对天然植物进行提取能有效浓缩其天然活性成分, 但提取工艺会产生安全性问题, 所以需进行安全性评估。本研究表明:配方沙棘籽提取物对两种性别的SPF级昆明种小鼠急性经口毒性试验, 一次灌胃给予剂量达到18.58 g/kg (相当于原花青素1.115 g/kg) , 在14天观察期内动物未见明显中毒症状和死亡, 为无毒级。遗传毒性试验 (小鼠骨髓细胞微核试验、Ames试验和精子畸形试验) 结果均为阴性。对SPF级Wistar大鼠连续经口灌胃给予30天未观察到有害作用水平 (NOAEL) 为5.00 g/kg (相当于原花青素0.3 g/kg) 。以上结果均说明配方沙棘籽提取物具有较好的安全性。
参考文献
[1] 金敬红, 孙晓明, 吴素玲.沙棘高效高值综合利用技术的研究[J].中国野生植物资源, 2015, 34 (4) :81-86.
[2] 王翔飞.沙棘籽渣的化学成分研究[D].杨凌:西北农林科技大学, 2006.
[3] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范[M].北京:中华人民共和国卫生部, 2003.
[4] 张慧文, 张玉, 马超美.木原花青素的研究进展[J].食品科学, 2015, 36 (5) :296-304.
[5] 谢文利, 孙静, 赵艳威, 等.原花青素的降血糖作用及急性毒性研究[J].中草药, 2009, 40 (10) :1615-1616.
[6] 陈会丛, 翟建英, 张广平, 等.葡萄籽原花青素的毒理学研究[J].食品工业科技, 2014, 35 (2) :317-323.